Имплантация нейрональных клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток

Нейроны и глиальные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, хорошо приживаются при пересадке их в нервную систему. Тератомы, содержащие другие типы клеток, включая мышечные и хрящевые, образуются чаще, если имплантируются дезаг­регированные клетки. Deacon et al. (1998) имплантировали эмбриональные стволовые клетки, дифференциро­ванные ретиноевой кислотой, в полосатое тело взрослой мыши и крысы, а также в капсулу почки мыши.

Через 2-4 недели, независимо от места введения, имплантаты содержали смешан­ные популяции клеток, однако большинство из них имело дофаминергический и серотонинергический фенотипы. Интересно, что предварительная обработка рети­ноевой кислотой не имела никакого эффекта в отношении линий происхождения в имплантате. Не наблюдалось также никакой региональной специфики в типах кле­ток, представленных в имплантате. Это свидетельствует о том, что дифференциров­ка была скорее клеточно-автономной, чем управляемой локальными факторами ро­ста. Эти факты можно объяснить тем, что взрослый мозг является в значительной степени объединенным фактором роста, а эмбриональные тельца сами могут давать достаточно факто­ров роста и дифференцировки для стимуляции дифференцировки клеток.

Benninger et al. (2000) показали, что при воздействии на эмбриональные тельца факторами роста (фактор роста нервов, BDNF или NT3) не было никакого эффекта на дифферен­цировку трансплантатов In vivo. Однако при культивировании эмбриональных телец в бессыворо­точной среде значительно уменьшилось количество неневральных клеток после трансплантации.

При использовании метода 4-, 4+, сопровождаемого выращиванием в среде, разработанной для дифференцировки глиальных клеток, которая содержит NT3 и CNTF, были получены олигодендроциты (более 92 %). При этом вводится один дополнительный этап, в котором плохо прилипающие клетки (олиго-) отде­ляются от прилипающих астроцитов путем встряхивания. Полученные клетки выращиваются как «олигосферы» путем посева в чашки. Сформированные таким путем олигодендроциты способны миелинизировать аксоны In vitro, создавая мие­линовые оболочки (10 15 слоев) через 9 дней In vitro. Олигосферы пересаживали в спинной мозг крысы, пораженный химическими веществами (бромид этидия или лизолецитин), или треморным мутантным мышам, которые испытывают не­достаток основного белка миелина (shi/shi). При явном присутствии других кле­ток опухолей не было и через 2-4 недель In vivo наблюдалась миелинизация аксонов на расстоянии 0,5 мм с разбросанными очагами до 2-3 мм от места инъекции. Хотя в данном исследовании не выявлено восстановление функции, в предыдущих ис­следованиях авторы установили, что при трансплантации эмбриональных телец, сформированных методом 4-, 4+ (без стадии олигосферы), в спинной мозг, пораженный контузи­ей, значительно улучшилась опорно-двигательная функция. Однако еще предстоит определить длительность выживания олигосферных имплантатов и их действие на восстановление функций.

Поскольку нейроразвивающееся и нейродегенеративное заболевания могут использовать общий патогенетический базис, дифференцировка эмбриональных стволовых клеток может идентифицировать соответствующие гены или восприимчивые типы клеток. Экс­прессия, специфичная для линии происхождения белков невральных заболеваний, была исследована в эмбриональных стволовых клетках и эмбриональных тельцах и, удивительно, что экспрессировались многие гены неврологических заболеваний. Например, α-синуклеин (экспрессируемый при болезни Паркинсона) экспрессируется в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, затем ре­гулируется на понижение экспрессии. Другие белки ассоциированны с невроло­гическими заболеваниями:

• фратаксин (атаксия Фредериха),
• атаксин (спиноцеребральная атаксия),
• презениллин 2 (болезнь Альцгеймера),

Экспрессируются при дифференцировке эмбриональных телец, но не в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках, и присутствуют в Oct4+ потомстве (олигодендроциты).

Нейронная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток показа­ла, что широко экспрессируемый, важный для развития ген «huntington» (хантингтон) не яв­ляется существенным для дифференцировки функциональных нейронов. Пред­полагается, что потеря функционального «huntington» гена вряд ли приведет к нейродегенеративным изменениям, характерным для болезни Гентингтона. Показано, что «вбивание» повторений триплета ЦАТ в локус HPRT эмбриональной стволовой клетки (как модель болез­ни Гентингтона) приводит к ухудшению заболевания, зависимо от дозы, фактор транскрипции Oct 3/4, кодированный геном Pou5f, Rex-1 и нейрон-рес-трикционный фактор гашения (nrsf/REST). Можно также проверить многие из генов, эксирессируемых клетками внутренней массы или примитивной экто­дермы.

При использовании любого метода изучения дифференцировки важно пока­зать, что маркеры стволовых клеток экспрессируются на высоком уровне в началь­ной популяции и регулируются на понижение при дифференцировке. Это реша­ющий момент в выяснении факта: имеется ли остаточная популяция стволовых клеток, которая могла бы быть имплантирована неумышленно или же через диф­ференциальное выживание клеток могла бы избирательно искажать результаты экспериментов по дифференцировке.

Так как выращивание эмбриональных стволовых клеток на желатине стимулирует экспрессию некоторых маркеров дифференцировки, то использование рибонуклеиновых кислот из бла­стоцист — дополнительный важный контроль. Необходимы также хорошие мар­керы дифференцированного потомства, как и набор генов, типичных для множе­ства дифференцированных типов клеток.

К сожалению, универсального маркера стволовых кле­ток не существует. Антигены класса С 134 эффективны в сортировке многих ти­пов кроветворных стволовых клеток. Факторы, которые «лицензируют» клетки на перенесение репликации, могут метить стволовые клетки. Многие стволовые клетки исключают Hoechst 33324. Ни один из этих маркеров не идентифицирует все классы стволовых клеток.