Линейная селекция стволовых клеток

Селекция линий клеток также использовалась для получения популяций кле­ток высокой чистоты. Селекция линий или выборочное удаление клеток, не экспрессирующих рестриктирующего линию гена, позволяет получить популяцию очень высокой чистоты (98-99 %), но рассчитана на непрерывную экспрессию клетками конкретной промоторной конструкции или транзиторную селекцию во время окна его экспрессии.

Мс Whir et al. (1996) использовали данный ме­тод для отбора и культивирования эмбриональных стволовых клеток от мышей линии СВА. Ген Oct-3/4, ог­раничивающий стволовые клетки, использовался для экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы — гена устойчивости к этому антибиотику. При культивиро­вании бластоцист в среде, содержащей неомицин, выживали только стволовые клетки (Oct3/4+).

Селекция клеточных линий применялась для создания практически гомоген­ных популяций клеток сердечной мышцы путем введения в стволовые клетки про­мотора тяжелой цепи кардиального альфа-миозина, присоединенного к гену неомицин-фосфотрансферазы. После того как устойчиво трансфицированные клет­ки были дифференцированы как клетки внутренней клеточной массы, а затем се­лектированы антибиотиком, 99,6% выживших клеток составляли кардиомиоци­ты, которые успешно функционировали после интеграции в желудочковый мио­кард мышей mclx.

Используя аналогичный методический подход Li et al. (1998), поместили блок устойчивости к неомицину в локус Sox 2 (Sox 1, 2 эксп­рессируются в раннем нейроэпителии). Эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы в услови­ях, способствующих развитию нейронов, затем подверглись действию G418 для отбора нейроэпителиальных клеток-предшественников, экспрессирующих Sox 2 (и новых клеток), давая высокообогащенные нейронами культуры.

Направления дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши

Метод отбора клеточных линий очень эффективен для получения очищенных типов клеток. Однако дифференцировка в агрегатах гетерогенна, так как некото­рые клетки дифференцируются быстрее, чем другие. Тогда значимым становится то, что ген отбора (в частности, тот, что экспрессируется в «клетках-предшественниках», а не в дифференцируемых производных) будет неустойчиво экспрессироваться таким образом, что окно отбора становится очень узким.

Линейная селек­ция — отличный подход к выделению клеток с конкретным фенотипом, но при изучении, например, действия на клетки факторов роста дифференцировка под­вергает эмбриональные стволовые клетки влиянию множественных неуправляемых (фактически неизвестных) сигналов дифференцировки и роста. Многие клетки не будут давать начало новым клеткам и селекция подвергнет эмбриональные стволовые клетки действию дополнительных цитокинов, каспасов и других факторов, высвобождаемых апоптотическими клетками.

При известных условиях культивирования (или факторах роста), которые вы­зывают экспрессию гена селекции линии клеток, трансфекция эмбриональных стволовых клеток промотора­ми/усилителями экспрессии гена, устойчивого к антибиотику, может давать ли­нии клеток-предшественников для дополнительного изучения дифференцировки, опосредованной фактором роста, субстратом и т. д. Так, этот метод был применен для развития предшественников нейроэпителиальных клеток с использованием второго экзона (CNS-специфического) гена нести на для экспрессии неоцитов в эмбриональные стволовые клетки.

Селекция линий клеток необходима при получении большого количества высокоочищенных клеток, например, для трансплантации в поврежденные ткани. Однако изучение влияния факторов роста на сегрегацию происхождения «линии клеток» лишено смысла, так как многие из генов экспрессируются скорее в зре­лых, чем в переходных популяциях. Полученные клетки уже закончили отбор сво­их линий происхождения и обычно являются постмитотическими.